Анализ на кариотип

«Почему так долго? Мне надо срочно!» Или вся правда об анализах на кариотип

Наталья Опарина

20.03.201516:55

Врач-цитогенетик

Дорогие друзья! Сегодня я попытаюсь ответить на самый задаваемый вопрос: почему так долго делается анализ кариотипа? Начнем, как говорится, ab ovo, т.е. «от яйца»Всю процедуру кариотипирования можно разбить на 2 этапа.Этап первый: технический — приготовление препаратов для анализаДавайте разберем подробнее, что же это такое. Итак, из курса биологии вы знаете, что хромосомы расположены в ядре клетки. Любые клетки любых тканей организма, имеющие ядро, содержат хромосомы. Однако, в медицинской практике, набор тканей, используемых для получения хромосом, ограничен. Главным требованием в этом вопросе является простота получения образца для исследований. И с этой позиции кровь является идеальным кандидатом. Забор венозной крови легко осуществить в любом медицинском учреждении, это практически безболезненная и быстрая по времени процедура. Взятую в пробирку порцию крови легко транспортировать в лабораторию и т. д. Но есть и минусы. Дело в том, что не все клетки крови содержат ядро.  Эритроциты, например, не содержат и для анализа не годятся. Самые многочисленные ядросодержащие клетки, это лейкоциты и лимфоциты. Но и это еще не все подводные камни. Лейкоциты и лимфоциты, циркулирующие в крови взрослого здорового человека, называются «зрелыми» и не способны делиться (размножаться). А нам для анализа нужно получить не просто делящиеся клетки, но и остановить процесс деления строго на определенной стадии, называемой «метафаза». Что бы этого добиться, мы, цитогенетики, прибегаем к целому ряду ухищрений: стимулируем клетки специальным веществом, под воздействием которого они «превращаются» в «незрелые» или бласты и начинают делиться. Кроме того, помещаем клетки в специальную культуральную среду, которая содержит все необходимые элементы для жизнедеятельности, ведь, извлеченные из организма клетки крови должны чем-то питаться, для того, чтобы не только жить, но и размножаться. Полный клеточный цикл (все стадии деления) длится 24 часа. Для того, чтобы врач смог приступить к анализу хромосом, необходимо, что бы делящихся клеток было как можно больше, поэтому для получения качественных препаратов хромосом клетки культивируют (выращивают) 72 часа=3 клеточных цикла=3 суток. Но и это еще не все! Теперь нужно сделать так, чтобы хромосомы стали доступны для исследования, т.е. извлечь их из ядра, поместить на стекло, да еще добиться того, что бы они с этого стекла не соскользнули. Весь этот процесс называется обработкой препарата и длиться около 5 часов. А дальше хромосомы нужно визуализировать, покрасить специальными биологическими красителями. Но вот беда-свежие, только что полученные препараты для этого не годятся. Их нужно «состарить». Т.е. 2-3 суток стекла просто лежат и ждут своей очереди. Этот этап чрезвычайно важен, так как позволяет получить хорошую окраску хромосом, без получения которой анализ невозможен! Итого мы имеем: 3 суток инкубация + 5 часов (рабочий день) фиксация + 3 суток подготовка к окрашиванию = 7 дней или целая неделя. Столько времени уходит на технический этап и то при условии, что все пройдет без сбоев и ничего не придется переделывать. А дальше наступает второй этап: аналитический — исследование хромосом , о котором мы поговорим в следующий раз.Если у вас возникают вопросы-спрашивайте, я постараюсь на них ответить. Наиболее часто задаваемые вопросы будут служить темами для следующих бесед.Что означают полоски на хромосомах? Продолжаем обсуждать кариотип!

Подготовка к анализу

Так как для анализа на определение кариотипа используются кровяные клетки, необходимо исключить влияние различных факторов, которые осложняют их рост, что делает анализ неинформативным.

Примерно за 2 недели до сдачи крови на анализ кариотипирования следует предотвратить или отказаться от воздействия следующих факторов:

• наличие острых заболеваний или обострение хронических;
• прием лекарственных препаратов, особенно антибиотиков;
• употребление алкоголя и курение.

Чтобы лучше выявить структуру хромосом, их окрашивают. Каждая хромосома имеет свою индивидуальную исчерченность, что становится хорошо заметным после окрашивания. Затем проводится анализ окрашенных мазков, во время которого определяется общее количество хромосом и структура каждой. При этом сопоставляется исчерченность парных хромосом, а полученный результат с нормами цитогенетических схем хромосом.

Для анализа обычно требуется не более 12-15 лимфоцитов, данное количество клеток позволяет выявить количественное и качественное несоответствие хромосом, а, следовательно, наследственное заболевание.

Отклонения в кариотипе: что делать

Корректировать нарушения или использовать донорскую сперму или яйцеклетку для искусственного оплодотворения зависит от ситуации. Некоторые генные патологии неизлечимы. В таких случаях рекомендуется либо прервать беременность, если она есть, либо подготовиться к возможным врожденным заболеваниям ребенка.

Если риск рождения ребенка с аномалиями невысок, можно на этапе подготовки и в дальнейшем при вынашивании корректировать изменения. Например, принимать специальные витаминно-минеральные комплексы, чтобы минимизировать вероятность отклонений при формировании и развитии плода.

Половой хроматин в судебно-медицинском отношении

Исследование П. х. в суд.-мед. практике производится с целью установления половой принадлежности следов крови, слюны и других биол, жидкостей, вырванных волос, следов-отпечатков клеток тканей и органов, кусочков тканей, которые могут быть обнаружены на месте происшествия, на различных предметах, одежде, теле потерпевшего и подозреваемого в совершении преступления, на орудиях травмы, на транспортных средствах, а также при обнаружении обгоревших трупов или частей расчлененных трупов. Реже П. х. исследуют с целью суд.-мед. установления генетического пола у лиц с аномалиями полового развития, используя общепринятые методики.

Для приготовления препаратов из следов крови (см.) и слюны (см.) кусочки предмета-носителя помещают в пробирку и заливают 0,5—40% (следы крови) или 5—10% (следы слюны) уксусной к-той. Экстрагируют при комнатной температуре в течение нескольких часов и, удалив кусочки предмета-носителя, центрифугируют. Осадок переносят на предметное стекло и высушивают на воздухе. С пятен крови на предметах, не впитывающих жидкость (металл, стекло, пластмасса и др.), делают соскобы, которые затем обрабатывают таким же образом.

При исследовании волос (см.) корень волоса помещают на предметное стекло и добавляют 10—25% уксусную к-ту. После набухания отделяют и измельчают волосяной фолликул, удаляя остальные части волоса.

Из кусочков тканей и органов, при необходимости предварительно выдержав их до набухания в уксусной к-те соответствующей концентрации или в физиол, р-ре, готовят гистологические препараты, мазки или препараты-отпечатки. Следы-наложения клеток, тканей или органов на орудиях травмы смывают физиол, р-ром, одновременно соскабливая их. Мелкие кусочки тканей, встречающиеся в таких следах, измельчают препаровальными иглами. Смывы-соскобы помещают в пробирки, центрифугируют, из осадка готовят гистологические препараты. Исследование препаратов целесообразно начинать с выявления Y-хроматина, т. к. при его отсутствии те же препараты могут быть снова использованы для выявления X-хроматина. При исследовании учитывают только достаточно хорошо сохранившиеся неповрежденные ядра клеток. При анализе следов крови Y-хроматин определяют в ядрах лимфоцитов, т. к. в нейтрофилах Y-хроматин в препаратах из следов крови мужчин может не выявляться.

При отсутствии повышенной влажности Половой хроматин может длительно сохраняться в высохших следах, а также в клетках фолликула вырванного волоса. Высокая температура (выше 150°) разрушает ядра клеток и П. х. Значительная влажность в течение нескольких суток также приводит к разрушению клеток, что делает невозможным выявление полового хроматина. Т. к. условия, в к-рых находятся следы, могут последовательно меняться, решающее значение для установления пригодности следов крови, слюны и т. д. для определения П. х. имеет состояние обнаруживаемых в них клеток и их ядер. В клетках высохших кусочков тканей, не подвергающихся действию влаги, П. х. сохраняется длительное время. В целых трупах и в их крупных частях в процессе аутолиза и гниения в течение нескольких суток происходит деструкция клеточных ядер. В обгоревших трупах половой хроматин нек-рое время может сохраняться в клетках глубоко расположенных органов и тканей.

При выявлении небольшого числа клеток, сохранивших ядра, исследуемых на Половой хроматин, с целью установления статистической достоверности результатов используют различные математические методы анализа, учитывающие как общее число обнаруженных клеток, так и число клеток. содержащих X- или Y-хроматин.

Библиография: Давиденкова Е. Ф., Берлинская Д. К. и Тысячнюк С. Ф. Клинические синдромы при аномалиях половых хромосом, Л., 1973; Захаров А. Ф. Хромосомы человека, М., 1977; Капустин А. В. Судебно-медицинская диагностика пола по половым различиям в клетках, М., 1969; Лабораторные и специальные методы исследования в судебной медицине, под ред. В. И. Пашковой и В. В. Томилина, с. 157, М., 1975; Любинская С. И. и Антонова С. Н. Исследование Y-хроматина в следах крови, Суд.-мед. экспертиза, т. 18, № 3, с. 17, 1975; Основы цитогенетики человека, под ред. A. А. Прокофьевой-Бельговской, М., 1969; Methods in human cytogenetics, ed. by H. G. Schwarzacher a. U. Wolf, p. 207, B. а. о., 1974; The sex chromatin, ed. by K. L. Moore, Philadelphia — L., 1966.

Ранние признаки

В отличие от большинства заболеваний, связанных с нарушением количества хромосом, внутриутробное развитие детей с синдромом Клайнфельтера проходит нормально, склонности к преждевременному прерыванию беременности не наблюдается. Так что в младенческом и раннем детском возрасте заподозрить патологию практически невозможно. Более того, клинические признаки классического синдрома Клайнфельтера проявляются, как правило, только в подростковом периоде. Однако есть симптомы, которые позволяют заподозрить наличие синдрома Клайнфельтера в препубертатном периоде:

• высокий рост (пик прибавки роста приходится на период между 5–8 годами);
• длинные ноги (непропорциональное телосложение);
• высокая талия.

У части пациентов наблюдается некоторая задержка в развитии речи.

В подростковом возрасте синдром часто проявляется гинекомастией, которая при данной патологии имеет вид двустороннего симметричного безболезненного увеличения грудных желез. Так как такого рода гинекомастия часто наблюдается у совершенно здоровых подростков, этот симптом часто остается без внимания. В норме подростковая гинекомастия бесследно исчезает в течение нескольких лет, у пациентов же с синдромом Клайнфельтера обратной инволюции грудных желез не происходит. В некоторых случаях гинекомастия может не развиваться вовсе, и тогда патология проявляется признаками андрогенной недостаточности уже в постпубертатный период.

Кому и зачем назначают анализ на кариотип

В зависимости от диагноза специалист может рекомендовать кариотипирование пары, которая хочет родить здорового ребенка или плода, если есть риски врожденных патологий. Лабораторные исследования хромосом врачом-генетиком позволяет выявить возможные отклонения:

• трисомию, при которой в паре появляется третья хромосома;
• моносомию — отсутствие одной из хромосом в паре;
• делецию, при которой утрачен один из хромосомных участков (наиболее распространенная причина мужского бесплодия из-за нарушенного сперматогенеза);
• дупликацию — аномалии со сдвоенным фрагментом хромосомного набора;
• транслокацию: перемещение участков (рокировка) в ДНК цепочке;
• инверсию, при которой измененный участок разворачивается по оси.

Поскольку в хромосомных парах человека заложена наследственная информация: особенности телосложения, рост, цвет волос и глаз и даже склонность к заболеваниям, видоизменения в качестве или количестве хромосом приводят к «сбоям» в генетической программе. Если провести ассоциацию, подобные нарушения похожи на вирус в компьютерных файлах: незаметные на первый взгляд изменения приводят к серьезным поломкам.

Природой в организм заложена защита от серьезных патологий. Если есть отклонения от нормы, «блокировка» беременности наступает естественным путем. Результат: бесплодие (невозможность зачатия или выкидыш на ранних сроках).

Качественное исследование хромосом дает возможность исключить:

• Вероятность генных мутаций. При подозрениях на высокий риск возможно образование тромбов и нарушение кровотока, что грозит нарушениями при формировании плаценты. Итог: отслоение защитной оболочки плода, выкидыш, бесплодие.
• Мужское бесплодие из-за изменений У хромосомы у партнера. При такой аномалии необходимо оплодотворение донорской спермой.
• Мутацию хромосом, которые отвечают за способность организма к детоксикацию (выведения токсичных веществ и защиту от негативных внешних факторов).
• Генные патологии, которые гарантированно передадутся ребенку.

Факт! Своевременно проведенное генетическое исследование — это возможность до беременности выявить скрытые патологии. Например, если у родителей нет заболеваний кровеносной, сердечно-сосудистой, эндокринной, нервной или опорно-двигательной систем, а в роду наблюдались такие отклонения, исследование поможет диагностировать и рассчитать риск врожденной склонности к инфаркту, сахарному диабету, гипертонии, патологиям суставов.

Скрининг одного или обоих супругов на носительство наиболее распространенных моногенных заболеваний

Этот скрининг можно смело предлагать всем парам. Почему? Все мы — носители хотя бы нескольких аутосомно-рецессивных моногенных заболеваний. Как правило, мы об этом не знаем, так как второй ген из парной хромосомы от другого родителя без поломок, и болезнь себя никак не проявляет. Если же супруги носители одного и того же заболевания, то риск рождения больного ребёнка составляет 25%.

В связи с этим некоторые банки донорских клеток тестируют всех своих доноров на носительство наиболее распространенных в популяции моногенных заболеваний. Очевидно, что скрининг тоже перестраховка, и что риск рождения больного ребёнка низкий (не выше 1 на 1000). Но если вдруг в результате проведения ЭКО с применением донорских клеток или у совершенно здоровой пары родится ребёнок с неизлечимым генетическим заболеванием с тяжелыми проявлениями, то последствия будут плачевны.

Если вы еще сомневаетесь, стоит ли вам проходить это тестирование, исключите хотя бы носительство СМА, спинальной мышечной атрофии! В основную панель включены также нейросенсорная тугоухость, муковисцидоз, фенилкетонурия, адреногенитальный синдром.

Аберрации

При синдроме Дауна существует три копии хромосомы 21.

Хромосомные аберрации — это нарушения нормального хромосомного содержимого клетки и основная причина генетических состояний у людей, таких как синдром Дауна , хотя большинство аберраций практически не имеют эффекта. Некоторые хромосомные аномалии, такие как транслокации или хромосомные инверсии , не вызывают заболевания у носителей, хотя они могут повысить вероятность вынашивания ребенка с хромосомным заболеванием. Аномальное количество хромосом или наборов хромосом, называемое анеуплоидией , может привести к летальному исходу или вызвать генетические нарушения. Генетическое консультирование предлагается семьям, в которых может быть хромосомная перестройка.

Получение или потеря ДНК хромосом может привести к множеству генетических нарушений . Примеры людей включают:

• Cri du chat , вызванная удалением части короткого плеча хромосомы 5. «Cri du chat» на французском языке означает «крик кошки»; заболевание было названо так потому, что пораженные дети издают пронзительные крики, похожие на кошачьи. Больные имеют широко расставленные глаза, небольшую голову и челюсть, умеренные или серьезные проблемы с психическим здоровьем и очень короткие.
• Синдром Дауна , наиболее распространенная трисомия, обычно вызванная дополнительной копией хромосомы 21 ( трисомия 21 ). Характеристики включают снижение мышечного тонуса, более коренастое телосложение, асимметричный череп, раскосые глаза и нарушение развития от легкой до средней степени.
• Синдром Эдвардса , или трисомия-18, вторая по частоте трисомия. Симптомы включают задержку моторики, нарушение развития и многочисленные врожденные аномалии, вызывающие серьезные проблемы со здоровьем. Девяносто процентов заболевших умирают в младенчестве. У них характерные сжатые руки и пальцы внахлест.
• Изодицентрический 15 , также называемый idic (15), частичная тетрасомия 15q или инвертированная дупликация 15 (inv dup 15).
• Синдром Якобсена , который встречается очень редко. Это также называется терминальным нарушением делеции 11q. Пострадавшие имеют нормальный интеллект или легкие отклонения в развитии, с плохими навыками выразительной речи. У большинства из них есть нарушение свертываемости крови, называемое синдромом Пари-Труссо .
• Синдром Клайнфельтера (XXY). Мужчины с синдромом Клайнфельтера обычно бесплодны, обычно выше и имеют более длинные руки и ноги, чем их сверстники. Мальчики с этим синдромом часто застенчивы и тихи, чаще страдают задержкой речи и дислексией . Без лечения тестостероном у некоторых может развиться гинекомастия в период полового созревания.
• Синдром Патау , также называемый D-синдромом или трисомией-13. Симптомы несколько схожи с симптомами трисомии-18, но без характерной сложенной руки.
• Маленькая дополнительная маркерная хромосома . Это означает, что есть лишняя аномальная хромосома. Характеристики зависят от происхождения дополнительного генетического материала. Синдром кошачьего глаза и isodicentric хромосомы 15 синдром (или Idic15) оба вызваны нештатными маркера хромосомой, как синдром Паллистер-Киллиан .
• Синдром Triple-X (XXX). XXX девушки, как правило, высокие и худые и чаще страдают дислексией.
• Синдром Тернера (X вместо XX или XY). При синдроме Тернера женские половые признаки присутствуют, но недостаточно развиты. Женщины с синдромом Тернера часто имеют низкий рост, низкий рост волос, аномальные черты глаз и развитие костей, а также вид «вдавленной» груди.
• Синдром Вольфа – Хиршхорна , который вызван частичной делецией короткого плеча хромосомы 4. Он характеризуется задержкой роста, задержкой развития моторики, чертами лица «греческого шлема» и легкими или серьезными проблемами психического здоровья.
• XYY-синдром . Мальчики XYY обычно выше своих братьев и сестер. Подобно XXY мальчикам и XXX девочкам, они чаще испытывают трудности в обучении.

Анеуплоидия спермы

Воздействие на мужчин определенного образа жизни, окружающей среды и / или профессиональных опасностей может увеличить риск анеуплоидных сперматозоидов. В частности, риск анеуплоидии увеличивается при курении табака и воздействии бензола, инсектицидов и перфторированных соединений на рабочем месте. Повышенная анеуплоидия часто связана с повышенным повреждением ДНК в сперматозоидах.

Наблюдения за кариотипами

Окрашивание

Изучение кариотипов стало возможным благодаря окрашиванию . Обычно подходящий краситель , такой как Гимза , наносится после того, как клетки были арестованы во время деления клеток раствором колхицина, обычно в метафазе или прометафазе, когда он наиболее конденсирован. Чтобы краситель Гимзы прилипал правильно, все хромосомные белки должны быть переварены и удалены. Чаще всего для людей используются белые кровяные тельца , поскольку их легко заставить делиться и расти в тканевой культуре . Иногда можно наблюдать неделящиеся ( интерфазные ) клетки. Пол будущего плода можно определить путем наблюдения за интерфазными клетками (см. Амниотический центез и тельца Барра ).

Наблюдения

Обычно наблюдаются и сравниваются шесть различных характеристик кариотипов:

1. Различия в абсолютных размерах хромосом. Хромосомы могут различаться по абсолютному размеру до двадцати раз между родами одного и того же семейства. Например, бобовые Lotus tenuis и Vicia faba имеют по шесть пар хромосом, а хромосомы V. faba во много раз больше. Эти различия, вероятно, отражают разную степень дупликации ДНК.
2. Различия в положении центромер . Эти различия, вероятно, возникли в результате транслокаций .
3. Различия в относительном размере хромосом. Эти различия, вероятно, возникли из-за сегментарного обмена неравными длинами.
4. Различия в основном количестве хромосом. Эти различия могли быть результатом последовательных неравных транслокаций, которые удаляли весь важный генетический материал из хромосомы, допуская его потерю без ущерба для организма (гипотеза дислокации) или посредством слияния. У людей на одну пару хромосом меньше, чем у человекообразных обезьян. Человеческая хромосома 2, по-видимому, возникла в результате слияния двух наследственных хромосом, и многие гены этих двух исходных хромосом были перемещены в другие хромосомы.
5. Различия в количестве и положении спутников. Сателлиты — это маленькие тела, прикрепленные к хромосоме тонкой нитью.
6. Различия в степени и распределении гетерохроматических областей. Гетерохроматин окрашивается темнее, чем эухроматин . Гетерохроматин упакован плотнее. Гетерохроматин состоит в основном из генетически неактивных и повторяющихся последовательностей ДНК, а также содержащий большее количество аденина — тимин пара. Эухроматин обычно находится в активной транскрипции и окрашивается намного светлее, поскольку он имеет меньшее сродство к красителю Гимзы . ЭУ области содержат большее количество гуанина — цитозин пара. Техника окрашивания с использованием окрашивания по Гимзе называется G-полосой и поэтому дает типичные «G-полосы».

Таким образом, полное описание кариотипа может включать количество, тип, форму и распределение хромосом, а также другую цитогенетическую информацию.

Часто встречаются вариации:

1. между полами,
2. между зародышевой линией и сомой (между гаметами и остальной частью тела),
3. между членами популяции ( хромосомный полиморфизм ),
4. по географической специализации , и
5. в мозаиках или других аномальных людях.

Кариотип человека

кариотип человека (мужской)

Типичные кариотипы человека содержат 22 пары аутосомных хромосом и одну пару половых хромосом (аллосомы). Наиболее распространенные кариотипы самок содержат две X-хромосомы и обозначаются 46, XX; мужчины обычно имеют как X-, так и Y-хромосому, обозначенную 46, XY. Примерно 1,7% процентов людей являются интерсексуалами , иногда из-за различий в половых хромосомах.

Некоторые вариации кариотипа, будь то аутосомы или аллосомы, вызывают .

Что выявляет кариотипирование

Интерпретацию анализа на кариотипирование проводит врач-генетик. Анализ в норме выглядит как 46ХХ или 46ХУ. Но если выявлена какая-либо генетическая патология, например выявление третьей лишней 21 хромосомы у женщины, то результат будет выглядеть как 46ХХ21+.

Что позволяет определить анализ хромосомного набора:

• трисомия – третья лишняя хромосома в паре (например, синдром Дауна);
• моносомия – в паре отсутствует одна хромосома;
• делеция – утрата участка хромосомы;
• дупликация – удвоение какого-либо фрагмента хромосомы;
• инверсия – разворот участка хромосомы;
• транслокация – перемещение участков (рокировка) хромосомы.

Например, обнаружение делеции в У-хромосоме часто является причиной нарушенного сперматогенеза и, следовательно, мужского бесплодия. Также известно, что делеции являются причиной некоторых врожденных патологий у плода.

Для удобства отображения на бумаге результата анализа при обнаружении изменения структуры хромосомы, длинное плечо записывается латинской буквой q, а короткое t. Например, при потере фрагмента короткого плеча 5-ой хромосомы у женщины, результат анализа будет выглядеть так: 46ХХ5t, что означает синдром «кошачьего крика» (генетическое отклонение, характеризующееся характерным плачем ребенка и другими врожденными нарушениями).

Кроме того, кариотипирование позволяет оценить состояние генов. Путем данного метода исследования можно выявить:

• генные мутации, которые влияют на тромбообразование, что нарушает кровоток мелких сосудах при формировании плаценты или имплантации и может стать причиной выкидыша/бесплодия;
• генная мутация У-хромосомы (в данном случае необходимо использовать сперму донора);
• мутации генов, отвечающих за детоксикацию (низкая способность организма к обеззараживанию окружающих токсических факторов);
• генная мутация в гене муковисцидоза помогает исключить возможность данного заболевания у ребенка.

Кроме того, кариотипирование помогает диагностировать генетическую предрасположенность ко многим заболеваниям, например, к инфаркту миокарда, сахарному диабету, гипертонической болезни, патологии суставов и пр.